分光光度計技術(shù)原理、構造及應用

                    2023-01-14 10:02:16 點(diǎn)擊:3679

                    分光光度計技術(shù)原理、構造及應用


                    分光光度計原理是我們從事實(shí)驗室儀器研究和應用的人員需要掌握的知識。分光光度計就是利用分光光度法對物質(zhì)進(jìn)行定量定性分析的儀器。該儀器是實(shí)驗室、科研機構、醫療、農業(yè)、食品廠(chǎng)、飲用水廠(chǎng)等機構必備檢驗設備。已經(jīng)成為現代分子生物實(shí)驗室常規儀器。常用于核酸,蛋白定量以及細菌生長(cháng)濃度的定量。分光光度計基本原理是指采用一個(gè)可以產(chǎn)生多個(gè)波長(cháng)的光源,通過(guò)系列分光裝置,從而產(chǎn)生特定波長(cháng)的光源,光源透過(guò)測試的樣品后,部分光源被吸收,計算樣品的吸光值,從而轉化成樣品的濃度。樣品的吸光值與樣品的濃度成正比。單色光輻射穿過(guò)被測物質(zhì)溶液時(shí),被該物質(zhì)吸收的量與該物質(zhì)的濃度和液層的厚度(光路長(cháng)度)成正比,其關(guān)系如下式:

                    A=-lg(I/I。)=-lgT=kLc

                    式中 :

                    A 為吸光度;

                    I。為入射的單色光強度;

                    I 為透射的單色光強度;

                    T 為物質(zhì)的透射率;

                    k 為摩爾吸收系數;

                    L 為被分析物質(zhì)的光程,即比色皿的邊長(cháng);

                    c 為物質(zhì)的濃度。

                    物質(zhì)對光的選擇性吸收波長(cháng),以及相應的吸收系數是該物質(zhì)的物理常數。當已知某純物質(zhì)在一定條件下的吸收系數后可用同樣條件將該供試品配成溶液,測定其吸收度,即可由上式計算出供試品中該物質(zhì)的含量。在可見(jiàn)光區,除某些物質(zhì)對光有吸收外,很多物質(zhì)本身并沒(méi)有吸收但可在一定條件下加入顯色試劑或經(jīng)過(guò)處理使其顯色后再測定,故又稱(chēng)比色分析。由于顯色時(shí)影響呈色深淺的因素較多,且常使用單色光純度較差的儀器,故測定時(shí)應用標準品或對照品同時(shí)操作。



                    核酸的定量

                        核酸的定量是分光光度計使用頻率最高的功能??梢远咳苡诰彌_液的寡核苷酸,單鏈、雙鏈DNA,以及RNA。核酸的最高吸收峰的吸收波長(cháng)260nm。每種核酸的分子構成不一,因此其換算系數不同。定量不同類(lèi)型的核酸,事先要選擇對應的系數。如:1OD的吸光值分別相當于50μg/ml的dsDNA,37μg/ml的ssDNA,40μg/ml的RNA,30μg/ml的Olig。測試后的吸光值經(jīng)過(guò)上述系數的換算,從而得出相應的樣品濃度。測試前,選擇正確的程序,輸入原液和稀釋液的體積,爾后測試空白液和樣品液。然而,實(shí)驗并非一帆風(fēng)順。讀數不穩定可能是實(shí)驗者最頭痛的問(wèn)題。靈敏度越高的儀器,表現出的吸光值漂移越大。


                        事實(shí)上,分光光度計的設計原理和工作原理,允許吸光值在一定范圍內變化,即儀器有一定的準確度和精確度。如Eppendorf Biophotometer的準確度≤1.0%(1A)。這樣多次測試的結果在均值1.0%左右之間變動(dòng),都是正常的。另外,還需考慮核酸本身物化性質(zhì)和溶解核酸的緩沖液的pH值,離子濃度等:在測試時(shí),離子濃度太高,也會(huì )導致讀數漂移,因此建議使用pH值一定、離子濃度較低的緩沖液,如TE,可大大穩定讀數。樣品的稀釋濃度同樣是不可忽視的因素:由于樣品中不可避免存在一些細小的顆粒,尤其是核酸樣品。這些小顆粒的存在干擾測試效果。為了最大程度減少顆粒對測試結果的影響,要求核酸吸光值至少大于0.1A,吸光值最好在0.1-1.5A。在此范圍內,顆粒的干擾相對較小,結果穩定。從而意味著(zhù)樣品的濃度不能過(guò)低,或者過(guò)高(超過(guò)光度計的測試范圍)。最后是操作因素,如混合要充分,否則吸光值太低,甚至出現負值;混合液不能存在氣泡,空白液無(wú)懸浮物,否則讀數漂移劇烈;必須使用相同的比色杯測試空白液和樣品,否則濃度差異太大;換算系數和樣品濃度單位選擇一致;不能采用窗口磨損的比色杯;樣品的體積必須達到比色杯要求的最小體積等多個(gè)操作事項。


                        除了核酸濃度,分光光度計同時(shí)顯示幾個(gè)非常重要的比值表示樣品的純度,如A260/A280的比值,用于評估樣品的純度,因為蛋白的吸收峰是280nm。純凈的樣品,比值大于1.8(DNA)或者2.0(RNA)。如果比值低于1.8或者2.0,表示存在蛋白質(zhì)或者酚類(lèi)物質(zhì)的影響。A230表示樣品中存在一些污染物,如碳水化合物,多肽,苯酚等,較純凈的核酸A260/A230的比值大于2.0。A320檢測溶液的混濁度和其他干擾因子。純樣品,A320一般是0。


                    蛋白質(zhì)的直接定量(UV法)

                        分光光度計原理說(shuō)明的這種方法是在280nm波長(cháng),直接測試蛋白。選擇Warburg公式,光度計可以直接顯示出樣品的濃度,或者是選擇相應的換算方法,將吸光值轉換為樣品濃度。蛋白質(zhì)測定過(guò)程非常簡(jiǎn)單,先測試空白液,然后直接測試蛋白質(zhì)。由于緩沖液中存在一些雜質(zhì),一般要消除320nm的“背景”信息,設定此功能“開(kāi)”。與測試核酸類(lèi)似,要求A280的吸光值至少大于0.1A,最佳的線(xiàn)性范圍在1.0-1.5之間。實(shí)驗中選擇Warburg公式顯示樣品濃度時(shí),發(fā)現讀數“漂移”。這是一個(gè)正常的現象。事實(shí)上,只要觀(guān)察A280的吸光值的變化范圍不超過(guò)1%,表明結果非常穩定。漂移的原因是因為Warburg公式吸光值換算成濃度,乘以一定的系數,只要吸光值有少許改變,濃度就會(huì )被放大,從而顯得結果很不穩定。蛋白質(zhì)直接定量方法,適合測試較純凈、成分相對單一的蛋白質(zhì)。紫外直接定量法相對于比色法來(lái)說(shuō),速度快,操作簡(jiǎn)單;但是容易受到平行物質(zhì)的干擾,如DNA的干擾;另外敏感度低,要求蛋白的濃度較高。


                    比色法蛋白質(zhì)定量

                        蛋白質(zhì)通常是多種蛋白質(zhì)的化合物,比色法測定的基礎是蛋白質(zhì)構成成分:氨基酸(如酪氨酸,絲氨酸)與外加的顯色基團或者染料反應,產(chǎn)生有色物質(zhì)。有色物質(zhì)的濃度與蛋白質(zhì)反應的氨基酸數目直接相關(guān),從而反應蛋白質(zhì)濃度。

                        比色方法一般有BCA,Bradford,Lowry 等幾種方法。

                        Lowry 法:以最早期的Biuret反應為基礎,并有所改進(jìn)。蛋白質(zhì)與Cu2+反應,產(chǎn)生藍色的反應物。但是與Biuret 相比,Lowry法敏感性更高。缺點(diǎn)是需要順序加入幾種不同的反應試劑;反應需要的時(shí)間較長(cháng);容易受到非蛋白物質(zhì)的影響;含EDTA,Tritonx-100,ammonia sulfate 等物質(zhì)的蛋白不適合此種方法。

                        BCA(Bicinchoninine acid assay)法:這是一種較新的、更敏感的蛋白測試法。要分析的蛋白在堿性溶液里與Cu2+反應產(chǎn)生Cu+,后者與BCA形成螯合物,形成紫色化合物,吸收峰在562nm波長(cháng)。此化合物與蛋白濃度的線(xiàn)性關(guān)系極強,反應后形成的化合物非常穩定。相對于Lowry法,操作簡(jiǎn)單,敏感度高。但是與Lowry法相似的是容易受到蛋白質(zhì)之間以及去污劑的干擾。

                        Bradford法:這種方法的原理是蛋白質(zhì)與考馬斯亮蘭結合反應,產(chǎn)生的有色化合物吸收峰595nm。其最大的特點(diǎn)是,敏感度好,是Lowry和BCA 兩種測試方法的2倍;操作更簡(jiǎn)單,速度更快;只需要一種反應試劑;化合物可以穩定1小時(shí),方便結果;而且與一系列干擾Lowry,BCA反應的還原劑(如DTT,巰基乙醇)相容。但是對于去污劑依然是敏感的。最主要的缺點(diǎn)是不同的標準品會(huì )導致同一樣品的結果差異較大,無(wú)可比性。


                        某些初次接觸比色法測定的研究者可能為各種比色法測出的結果并不一致,感到迷惑,究竟該相信哪種方法?由于各種方法反應的基團以及顯色基團不一,所以同時(shí)使用幾種方法對同一樣品得出的樣品濃度無(wú)可比性。例如:Keller等測試人奶中的蛋白,結果Lowry,BCA測出的濃度明顯高于Bradford,差異顯著(zhù)。即使是測定同一樣品,同一種比色法選擇的標準樣品不一致,測試后的濃度也不一致。如用Lowry測試細胞勻漿中的蛋白質(zhì),以BSA作標準品,濃度1.34mg/ml,以a球蛋白作標準品,濃度2.64mg/ml。因此,在選擇比色法之前,最好是參照要測試的樣本的化學(xué)構成,尋找化學(xué)構成類(lèi)似的標準蛋白作標準品。另外,比色法定量蛋白質(zhì),經(jīng)常出現的問(wèn)題是樣品的吸光值太低,導致測出的樣品濃度與實(shí)際的濃度差距較大。關(guān)鍵問(wèn)題是,反應后1011分光光度計的重要配件——比色杯的顏色是有一定的半衰期,所以每種比色法都列出了反應測試時(shí)間,所有的樣品(包括標準樣品),都必須在此時(shí)間內測試。時(shí)間過(guò)長(cháng),得到的吸光值變小,換算的濃度值降低。除此,反應溫度、溶液PH值等都是影響實(shí)驗的重要原因。此外,非常重要的是,最好是用塑料的比色法。避免使用石英或者玻璃材質(zhì)的比色杯,因為反應后的顏色會(huì )讓石英或者玻璃著(zhù)色,導致樣品吸光值不準確。


                    細菌細胞密度(OD 600)

                        實(shí)驗室確定細菌生長(cháng)密度和生長(cháng)期,多根據經(jīng)驗和目測推斷細菌的生長(cháng)密度。在遇到要求較高的實(shí)驗,需要采用分光光度計準確測定細菌細胞密度。OD600是追蹤液體培養物中微生物生長(cháng)的標準方法。以未加菌液的培養液作為空白液,之后定量培養后的含菌培養液。為了保證正確操作,必須針對每種微生物和每臺儀器用顯微鏡進(jìn)行細胞計數,做出校正曲線(xiàn)。實(shí)驗中偶爾會(huì )出現菌液的OD值出現負值,原因是采用了顯色的培養基,即細菌培養一段時(shí)間后,與培養基反應,發(fā)生變色反應。另外,需要注意的是,測試的樣品不能離心,保持細菌懸浮狀態(tài)。


                    分光光度計的重要配件——比色杯

                    比色杯按照材質(zhì)大致分為石英杯、玻璃杯以及塑料杯。根據不同的測量體積,有比色杯和毛細比色杯等。一般測試核酸和紫外定量蛋白,均采用石英杯或者玻璃杯,但是不適合比色法測定。因為反應中的染料(如考馬斯亮蘭)能讓石英和玻璃著(zhù)色,所以必須采用一次性的塑料杯。而塑料杯一般不適合用于在紫外范圍內測試樣品。


                        由于另外測試的樣品量不同,所以一般分光光度計廠(chǎng)家提供不同容積的比色杯以滿(mǎn)足用戶(hù)不同的需求。目前市場(chǎng)已經(jīng)存在一種既可用于核酸、紫外蛋白質(zhì)定量,亦可用于蛋白比色法測定的塑料杯,樣品用量?jì)H需50μl,比色杯單個(gè)無(wú)菌包裝,可以回收樣品。如EppendorfUVette®塑料比色杯,是目前比色杯市場(chǎng)上一個(gè)革新。隨著(zhù)生命科學(xué)以及相關(guān)學(xué)科發(fā)展,對此類(lèi)科學(xué)的實(shí)驗研究提出更高的要求,分光光度計將是分子生物學(xué)實(shí)驗室不可缺少的儀器,也成為微生物、食品、制藥等相關(guān)實(shí)驗室的必備設備之一。


                    分光光度原理

                    基本原理

                        利用紫外光、可見(jiàn)光、紅外光和激光等測定物質(zhì)的吸收光譜,利用此吸收光譜對物質(zhì)進(jìn)行定性定量分析和物質(zhì)結構分析的方法,稱(chēng)為分光光度法或分光光度技術(shù),使用的儀器稱(chēng)為分光光度計,這種分光光度計靈敏度高,測定速度快,應用范圍廣,其中的紫外/可見(jiàn)分光光度技術(shù)更是生物化學(xué)研究工作中必不可少的基本手段之一。

                    1. 光譜:

                        光是電磁波,可用波長(cháng)“λ”表示,電磁波譜是由不同性質(zhì)的連續波長(cháng)的光譜所組成,對于生物化學(xué)來(lái)說(shuō),最重要的波長(cháng)區域是可見(jiàn)光和紫外光。

                        光的波長(cháng)是二個(gè)相鄰的波峰之間的距離。

                        光的傳播是由相互垂直的電場(chǎng)分量“E”和磁場(chǎng)分量“H”所構成。

                    λ=C/ν

                    λ——波長(cháng) C——光速 ν——頻率,單位時(shí)間通過(guò)一個(gè)定點(diǎn)的波數。

                    光又可以看作是由具有能量的粒子所組成。這些粒子所具有的原能量“E”由下式算出:

                    E=h•ν

                    H——普朗克常數( 6.624×10-27爾格•秒)

                    ν——頻率

                        紫外區可分為紫外(近紫外)和真空紫外(遠紫外)。由于吸收池(又稱(chēng)樣品池、比色杯等)和光學(xué)元件以及氧氣能吸收小于190nm波長(cháng)的光,因此常規紫外測定集中在近紫外區,即200nm~400nm??梢?jiàn)光區為400nm~800nm。

                        組成物質(zhì)的分子均處于一定能態(tài)并不停地運動(dòng)著(zhù),分子的運動(dòng)可分為平動(dòng)、轉動(dòng)、振動(dòng)和分子內電子的運動(dòng),每種運動(dòng)狀態(tài)都處于一定的能級,因此分子的能量可以寫(xiě)成:

                    E=E0+E平+E轉+E振+E電

                        E0是分子內在的不隨分子運動(dòng)而改變的能量,平動(dòng)能E平只是溫度的函數,因此與光譜有關(guān)的能量變化是分子的轉動(dòng)能量、振動(dòng)能量和分子的電子能量。

                        分子的每一種能量都有一系列的能級,能級不是任意的,而是具有量子化特征的,通常分子處于基態(tài),當它吸收一定能量躍遷到激發(fā)態(tài),則產(chǎn)生吸收光譜。分子轉動(dòng)、振動(dòng)和電子能級的躍遷,相應地產(chǎn)生轉動(dòng)、振動(dòng)及電子光譜。

                        按照量子力學(xué)原理,分子能態(tài)按一定的規律跳躍式地變化,物質(zhì)在入射光的照射下,分子吸收光時(shí),其能量的增加是不連續的,物質(zhì)只能吸收一定能量的光,吸收光的頻率和兩個(gè)能級間的能量差要符合下列關(guān)系:

                    E=E2- E1=h

                        E1、E2分別表示初能態(tài)和終能態(tài)的能量,初能態(tài)與終能態(tài)之間的能量差愈大,則所吸收的光的頻率愈高(即波長(cháng)愈短),反之則所吸收的光的頻率愈低(即波長(cháng)愈長(cháng))。由于吸收是不連續的,因此在光的一定部位出現一系列吸收暗帶。因為分子轉動(dòng)、振動(dòng)及電子能級躍遷的能量差別較大,因此,它們的吸收光譜出現在不同的光譜區域。分子轉動(dòng)能級級差小,△E<0.05電子伏特(ev),分子轉動(dòng)光譜的吸收出現在遠紅外或微波區。振動(dòng)能級縱間的差別較大,E=0.05~1.0 ev,振動(dòng)光譜出現在中紅外區。電子能級的級差更大, E=1~20ev,所以由電子躍遷得到的光譜出現在可見(jiàn)、紫外或波長(cháng)更短的光譜區。


                        分光光度計原理說(shuō)明,可見(jiàn)光、紫外光吸收光譜,是由于分子中聯(lián)系較松散的價(jià)電子被激發(fā)產(chǎn)生躍遷從而吸收光輻射能量形成的,即分子由基態(tài)變?yōu)榧ぐl(fā)態(tài),電子由一個(gè)低能級的軌道(即成鍵軌道),吸收了光能量躍遷到高能級軌道(稱(chēng)為反鍵軌道)。

                    與吸收光譜有關(guān)的三種電子是:

                    ⑴ 二個(gè)原子的電子沿其對稱(chēng)方向相互形成的共價(jià)鍵(即單鍵),稱(chēng)σ 鍵, 構成 鍵的電子稱(chēng)σ電子,如C-C、C-H鍵。

                    ⑵ 平行于二個(gè)原子軌道形成的價(jià)鍵(即雙鍵),稱(chēng)π 鍵,形成π鍵的電子稱(chēng)為 π電子,如C=C鍵。

                    ⑶ 未共享成鍵的電子,稱(chēng)n電子。

                    各種電子躍遷所需能量大小的順序是:

                    n→π*<π→π*≤ n→σ*<π→σ*<σ→π*<σ→σ*

                        紫外吸收光譜主要是由于雙鍵電子,尤其是共軛雙鍵中的π電子和未共享的電子對的激發(fā)所產(chǎn)生的。所以各種物質(zhì)分子對紫外光的吸光性質(zhì)取決于該分子的雙鍵數目和未共享電子對的共軛情況等。

                    如下表所示:

                    電子躍遷類(lèi)型與紫外吸收波長(cháng)(nm)關(guān)系表

                    電子躍遷類(lèi)型 例 子 紫外吸收波長(cháng)范圍

                    σ→σ* C-H 100~150 nm

                    π→π*( 非共軛 ) C=O <200 nm

                    π→π*( 共軛 ) =C-C= 200~300 nm

                    n→π* C=O ~300 nm

                    π→π*躍遷:此類(lèi)躍遷所需能量較小,吸收波長(cháng)在紫外區的200~300

                    nm,不飽和烴、共軛烯烴及芳香烴均可發(fā)生這類(lèi)躍遷,氨基酸、蛋白質(zhì)與核酸均含有大量共軛雙鍵,因而200~300

                    nm的紫外吸收測定,在生化實(shí)驗技術(shù)中有極廣泛的用途。

                    若逐漸改變照射某物質(zhì)的入射光的波長(cháng),并測定物質(zhì)對各種波長(cháng)光的吸收程度(吸光度“A”或光密度“O.D”)或透射程度(透光度“T”),以波長(cháng)λ作橫坐標,“A”或“T”為縱座標,畫(huà)出連續的“A~λ”或“T~λ”曲線(xiàn),即為該物質(zhì)的吸收光譜曲線(xiàn)。

                    吸光度 A

                    D

                    C

                    B

                    λmax λmin 波長(cháng)(nm)

                    由上圖可以看出吸收光譜的特征:

                    ⑴曲線(xiàn)上“A”處稱(chēng)最大吸收峰,它所對應的波長(cháng)稱(chēng)最大吸收波長(cháng),以λmax表示。

                    ⑵曲線(xiàn)上“B”處有一谷,稱(chēng)最小吸收,它所對應的波長(cháng),所對應的波長(cháng),稱(chēng)最小吸收波長(cháng),以λmin 表示。

                    ⑶曲線(xiàn)上在最大吸收峰旁邊有一小峰“C”,稱(chēng)肩峰。

                    ⑷在吸收曲線(xiàn)的波長(cháng)最短的一端,曲線(xiàn)上“D”處,吸收相當強,但不成峰形,此處稱(chēng)為末端吸收。

                        λmax是化合物中電子能級躍遷時(shí)吸收的特征波長(cháng),不同物質(zhì)有不同的最大吸收峰,所以它對鑒定化合物極為重要。吸收光譜中,λmax、λmin、肩峰以及整個(gè)吸收光譜的形狀決定于物質(zhì)的性質(zhì),其特征隨物質(zhì)的結構而異,所以是物質(zhì)定性的依據。

                        測定某物質(zhì)的紫外吸收光譜的曲線(xiàn),可與已知標準的紫外光譜圖相對照,對照時(shí)須注意測定的條件,如溶劑、濃度等。

                        常用標準的紫處吸收光譜是薩德勒研究實(shí)驗公司編制的“Sadtler”紫外標準圖譜集,到七十年代末為止已收集28585個(gè)化合物紫外光譜圖,此外還有藥物和非極性溶劑紫外光譜圖2000多幅。

                        由于化合物紫外吸收峰較少,而且峰形都很寬,不象紅外光譜是許多指紋峰,所以在用紫外吸收光譜進(jìn)行化合物定性鑒定時(shí),應注意:化合物相同,其紫外光譜應完全相同;但是紫外光譜相同不一定化合物就相同,可能僅是存在某些相同的發(fā)色團或基團,因此在鑒定時(shí)應與紅外光譜相結合。


                        由于電子躍遷的同時(shí)也引起分子的轉動(dòng)和振動(dòng)光譜,要把電子躍遷和分子振動(dòng)、轉動(dòng)的躍遷完全分開(kāi)是不可能的,因此我們常見(jiàn)的紫外吸收光譜是由一個(gè)或幾個(gè)寬的吸收譜帶所組成。

                        紫外光譜中常用的術(shù)語(yǔ)有發(fā)色團、助色團、增色效應和減色效應。

                        發(fā)色團:凡是與飽和碳氫化合物連接能引起n→π*、π→π*、 n→σ*

                        等電子躍遷的基團稱(chēng)為發(fā)色團。例如:C=C、C=O等發(fā)色團。

                        助色團:助色團是一些具有非共價(jià)鍵的基團(如OH、NH2、SH等)。這些基團在波長(cháng)>200nm處沒(méi)有吸收,當它與發(fā)色團相連接時(shí),使發(fā)色團的吸收帶向長(cháng)波移動(dòng),稱(chēng)為紅移(或淺色效應),紅移的同時(shí)吸收帶的強度增加。若助色團與發(fā)色團相連接,產(chǎn)生n→π* 躍遷,使吸收波長(cháng)向短波移動(dòng),稱(chēng)為蘭移(或深色效應)。


                    增色效應(hyperchromic effect):

                        核酸變性或降解,使得DNA或RNA溶液對紫外光的吸收明顯增加,即ε值(吸光系數或稱(chēng)消光系數)顯著(zhù)升高,此現象稱(chēng)為增色效應。此效應是由于堿基之間電子相互作用的改變所致,通常在260nm處測量。

                    減色效應(hypochromic effect):

                        在一定的條件下,變性的核酸又可以復性,此時(shí)ε值又明顯減少,回復到原來(lái)的核酸分子ε值較低的水平,即此時(shí)DNA或RNA溶液的紫外光吸收顯著(zhù)降低,此現象稱(chēng)為減色效應,此效應也是由于堿基之間電子相互作用的變化所引起的,通常在260nm條件下測量。

                    2. 光吸收定律:

                    朗伯——比爾(Lambert-beer)光吸收定律:

                    A=-lgT=εb c

                    A——吸光度,又稱(chēng)光密度“O.D”。

                    T——透光度, T=I / I。, I?!獮檎丈涞轿粘厣系墓鈴?,I——為透過(guò)吸收池的光強。

                    ε——摩爾吸光系數或克分子吸光系數(L•mol-1•cm-1)。

                    b——樣品光程(cm),通常使用1.0cm 的吸收地,b=1cm。

                    C——樣品濃度(mol/L)。

                        由上式可以看出:吸光度A與物質(zhì)的吸光系數“ε”和物質(zhì)的濃度“C”成正比。

                        摩爾吸光系數:是物質(zhì)對某波長(cháng)的光的吸收能力的量度。ε越大,吸收光的能力越強,相應的分光度法測定的靈敏度就越高。ε值越大,說(shuō)明電子躍遷的幾率大,通常ε=10~105:一般認為ε> 104為強吸收;ε=103~104 為較強吸收;ε< 102為弱吸收,此時(shí)分光光度法不靈敏。因為通常使用分光光度計可檢測出的最小吸光度A=0.001, 所以,當b=1cm,ε=105時(shí),可檢測的溶液最小濃度是C=10-8 mol/L。

                        常用的吸光系數還有一種百分吸光系數,即在某一波長(cháng)下,溶液濃度為1%(W /V),液層厚度b=1cm時(shí)的吸光度,以E1%λmax表示。

                    C——百分濃度(W / V)。

                    L——液層厚度,吸收杯光徑長(cháng)度。 A——吸光度。

                        最大吸收波長(cháng)λmax時(shí)的ε 和E1%λmax值可用下式換算:

                    ε=E1%λmax×分子量 / 10

                        吸光度“A”有一個(gè)重要性質(zhì)是其具有加和性:

                    A=ε1C1b1+ε2C2b2+ε3C3b3+……=

                        即混合物的總吸光度等于溶液中的各組份各自在該波長(cháng)下吸光度的算術(shù)和。這是多元混合物分光光度法定量分析的基礎。

                        若溶液中各溶質(zhì)的吸光系數ε相同,則各溶質(zhì)吸光度的大小與溶質(zhì)濃度成比例。例如,離子交換柱層析分離核苷酸實(shí)驗中可利用吸光度計算回收率:

                    m=C•V , ∵ , ∴

                    m——溶質(zhì)的量 C——溶質(zhì)濃度

                    V——溶液體積 A——吸光度

                    ε——吸光系數 b——吸收池光徑

                    ∴ 回收率 (100%)

                    (上式中假設ε總和各核苷酸的ε近似相等)

                    例一:尿嘧啶核苷酸溶液用1cm石英吸收池測定

                    260nm處的吸光度為0.650,用同一吸收池測定純溶劑的吸光度為0.070,計算尿嘧啶溶液的摩爾濃度,已知其摩爾吸光系數

                    = 8.2×103 M-1cm-1(M=mol / L)。

                    A= εbC ∵ A=(溶劑加樣品的吸光度)-(溶劑的吸光度)

                    A=0.650-0.070=0.580 ∵ b=1cm

                    C==7.1×10-5 mol / L

                    例二:1%(W/V,10 mg /

                    ml)酪氨酸酶溶液的吸光度為24.9(1cm吸收池,280nm),計算A280=0.250的酪氨酸酶溶液的濃度。

                    由于這兩種酶溶液的百分吸光系數“E1%1cm,280nm”是相同的,因此可用正比例法計算濃度。

                     C未知=0.01%=0.1mg / ml


                    分光光度計的組成和構造

                    1.組成:各種型號的紫外/可見(jiàn)分光度計,不論是何種型式,基本上都由五部分組成:(1)光源;(2)單色器(包括產(chǎn)生平行光和把光引向檢測器的光學(xué)系統);(3)樣品室;(4)接收檢測放大系統;(5)顯示或記錄器。

                         國產(chǎn)分光光度計近年來(lái)已有很大的發(fā)展,各種檔次的分光光度計都已更新升級換代,可見(jiàn)光系列有:721、722、723等型號,紫外/可見(jiàn)光系列有:751、752、753、754、756等型號,主要生產(chǎn)廠(chǎng)為上海譜元儀器等。

                        瑞士KONTRON康強公司生產(chǎn)的UNICON860型紫/可見(jiàn)光分光光度計,是雙光束、快速自動(dòng)掃描、熒屏顯示的高檔分光光度計。這種雙光束分光光度計的特點(diǎn)是來(lái)自光源的連續光譜經(jīng)凹面全息光柵分光后,由出射狹縫得到單色光,經(jīng)過(guò)由電機帶動(dòng)的25周/秒左右的旋轉鏡分解為“樣品”、“參比”光束,順序分時(shí)通過(guò)參比池和樣品吸收池,照射到光電倍增管上,由于兩條光路是幾乎同時(shí)測量,參比信號又不斷與標準電壓比較,使參比信號恒定,所以由光源、單色器、外界雜光、光電倍增管以及電源電壓等帶來(lái)的影響,儀器均能自動(dòng)消除。最快波長(cháng)掃描速度為1200nm/min,有五種測量功能和五種數據處理功能。

                    200分光光度計的樣品和參比光路,分別有各自的帶溫控的光電二極管檢測器,因而取消了電機帶動(dòng)的旋轉鏡,大大提高了儀器的穩定性及各項檢測指標,其波長(cháng)范圍是190nm~1100nm,吸光度測定范圍是0~3A,可變狹縫寬度為1nm、2nm和5nm,儀器使用微機控制時(shí),掃描速度最高可達6000nm/min,寬大的樣品室可以安裝各種附件,儀器性能優(yōu)良,適合教學(xué)、科研使用。該儀器的使用說(shuō)明詳見(jiàn)附錄。


                    2. 構造:

                    ⑴ 光源:

                        理想光源的條件是:①能提供連續的輻射;②光強度足夠大;③在整個(gè)光譜區內光譜強度不隨波長(cháng)有明顯變化;④光譜范圍寬;⑤使用壽命長(cháng),價(jià)格低。

                        用于可見(jiàn)光和近紅外光區的光源是鎢燈,現在最常用的是鹵鎢燈(Halogenlamp),即石英鎢燈泡中充以鹵素,以提高鎢燈的壽命。適用波長(cháng)范圍是320~1100nm。由于能量輸出的波動(dòng)為電壓波動(dòng)的四次方倍,因此電源電壓必須穩定。

                        用于紫外光區的是氘燈(Deuteriumlamp),適用波長(cháng)范圍是195~400nm,由于氘燈壽命有限,國產(chǎn)氘燈壽命僅五百小時(shí)左右,要注意節約燈時(shí)。

                    ⑵ 單色器:

                        單色器是分光光度計的心臟部分,它的作用是把來(lái)自光源的混合光分解為單色光并能隨意改變波長(cháng)。它的主要組成部件和作用是:

                    ①入射狹縫——限制雜散光進(jìn)入。

                    ②色散元件——即棱鏡或光柵,是核心部件,可將混合光分解為單色光。

                    ③準直鏡——把來(lái)自入射狹縫的光束轉化為平等光,并把來(lái)自色散元件的平等光聚焦于出射狹縫上。

                    ④出射狹縫——只讓額定波長(cháng)的光射出單色器。

                        轉動(dòng)棱鏡或光柵的波長(cháng)盤(pán),可以改變單色器出射光束的波長(cháng);調節出入射狹縫隙的寬度,可以改變出射光束的帶寬和單色光的純度。

                        光柵:光柵有透射光柵和反射光柵,實(shí)際應用的都是反射光柵,它又可分為平面反射光柵(即通稱(chēng)的反射光柵或閃爍光柵)和凹面反射光柵兩類(lèi),凹面反射光柵可以起色散元件和準直鏡兩個(gè)作用,使色散后的光束聚焦于出射狹縫,得到銳線(xiàn)光譜。


                    光柵的刻制方法有兩種:

                        機刻光柵:用金剛刀擠壓鍍于硬質(zhì)玻璃上0.5~1的鋁反射層而得??讨乒ぷ髁繕O大,一般每分鐘只能刻10條線(xiàn),刻100mm寬的600線(xiàn)/mm的光柵要100小時(shí)。最多刻到3600線(xiàn)/mm。由于其制造周期長(cháng),成本高,一般只能制得少量的母光柵,而實(shí)際應用的多是復制光柵,即在母光柵上涂上硅油,再鍍上一層鋁,用環(huán)氧樹(shù)脂粘下來(lái),就得到復制光柵。機刻光柵的缺點(diǎn)是線(xiàn)槽稍有缺陷時(shí)就會(huì )出現“鬼線(xiàn)”,即位于光譜強線(xiàn)兩側的模糊不清的假線(xiàn)。

                        全息光柵:用全息照相法刻制的高精度光柵。即用高強度的相干性極好的單色光,如激光,用高分辨的感光材料——光致抗蝕劑記錄干涉條紋,曝光1小時(shí),化學(xué)處理掉受光部分,再進(jìn)行真空鍍膜(鍍鋁),得到全息反射光柵。這種光柵幾乎沒(méi)有線(xiàn)槽間的周期誤差,幾乎沒(méi)有“鬼線(xiàn)”,雜散光很少。最大線(xiàn)槽密度可達6500線(xiàn)/mm,最大直徑可達400mm,刻線(xiàn)越多,分辨率就越高,最常用的是1200~1500線(xiàn)/mm的全息光柵。

                    狹縫、光譜頻帶寬度和分辨率:

                        出射狹縫的寬度通常有兩種表示方法:一為狹縫的實(shí)際寬度,以毫米(mm)表示,另一種為光譜頻帶寬度,即指由出射狹縫射出光束的光譜寬度,以毫微米nm表示。例如,出射狹縫的寬度是6nm,并不是說(shuō)出射狹縫的寬度是6nm,而是指由此狹縫射出的光具有6nm的光譜帶寬。

                        純粹的單色光只是一種理想情況,分光光度計所能得到的“單色光”,實(shí)際上只是具有一定波長(cháng)范圍的譜帶,狹縫越寬,所包括的波長(cháng)范圍也愈寬。

                        對單色光純度來(lái)說(shuō),狹縫是愈窄愈好,但光的強度也就越弱,因此狹縫不能無(wú)限制地小,狹縫的最小寬度取決于檢測器能準確地進(jìn)行測量的最小光能量。目前達到的最小寬度為0.1nm。

                        光譜有效頻帶寬度“b’”——是檢測器檢測到的光能量為峰值一半處的二點(diǎn)間的波長(cháng)間隔,如下所示:

                    光強度 P

                    b’ ——光譜有效頻帶寬(nm)

                    b ——狹縫寬度(mm) 1/2h

                    ——線(xiàn)色散率 b’ 光譜有效頻帶寬b’

                    dλ——波長(cháng)差 1/2h

                    dS——出射狹縫平面上二條 波長(cháng)λ

                    光線(xiàn)(dλ)所分開(kāi)的距離(mm)

                        由上式可以看出,b’與b成正比, 與線(xiàn)色散率成反比。線(xiàn)色散率越大,則可得到的有效頻帶寬度越小。

                        分辨率:是儀器對相鄰的兩個(gè)峰可分辨的最小波長(cháng)間隔,是儀器分辨鄰近二條譜線(xiàn)的能力。

                        例如若可分開(kāi)鈉雙線(xiàn):則高的分辨率可達:R=105。所以,狹縫寬度b越小,光譜帶寬b’越小,分辨率就越高。

                        何種情況算是能夠分辨:定義為二條譜線(xiàn)的峰與谷處于同一位置時(shí),此二個(gè)峰認為是剛好能分辨。

                        由于光柵分光其色散是線(xiàn)性的,所以只用一種狹縫寬度對各種波長(cháng)的光的測量,其分辨率都相同,即狹縫寬度不必經(jīng)常調節。只要光強能達到要求,應使用盡可能小的狹縫寬度,以提高分辨率。

                    ⑶樣品室:包括有池架、吸收池(即比色杯)、以及各種可更換的附件。池架有普通池架和恒溫池架,恒溫池架有水恒溫池架和電恒溫池架。水恒溫池架需用循環(huán)水恒溫裝置打入循環(huán)水保持池架恒溫,控溫精度為0.1℃,電恒溫池架十分昂貴,控溫精度可達 0.05℃。

                        吸收池有光學(xué)玻璃杯和石英玻璃杯兩種。光學(xué)玻璃杯因為普通光學(xué)玻璃吸收紫外光,因此只能用于可見(jiàn)光,適用波長(cháng)范圍是400nm~2000nm。石英玻璃杯可透過(guò)紫外光、可見(jiàn)光和紅外光,是最常使用的吸收池,使用波長(cháng)范圍是180nm~3000nm。

                        吸收池的形狀有長(cháng)方形,方形和園筒形,光程可由0.1cm至10cm,最常用的是1cm池(容積3ml),光程要求極精確,透光的玻璃面要嚴格垂直于光路,有的石英杯上方刻有箭頭“→”,標明杯子使用時(shí)的透光方向,反方向使用會(huì )有偏差。

                        有各種用途的石英吸收池:如液體池、氣體池、微量池(容積5μl~1ml)、流動(dòng)池(測量連續流動(dòng)的樣品)、長(cháng)光徑池(測量稀溶液用)、可裝拆池(便于清洗)等。石英杯通常還配有玻璃或塑料蓋,用以防止樣品揮發(fā)和氧化,以及杯內樣品的快速混合。


                    吸收池使用注意事項:

                    ① 要徹底清洗,尤其是盛過(guò)蛋白質(zhì)等溶液,干后形成一層膜,不易洗去,通常杯子不用時(shí)可放在

                    1%洗潔凈液中浸泡,去污效果好,使用時(shí)用水沖洗干凈,要求杯壁不掛水珠,還可以用綢布絲線(xiàn)或軟塑料制作一個(gè)小刷子清洗杯子。

                    ② 嚴禁用手指觸摸透光面,因指紋不易洗凈。嚴禁用硬紙和布擦拭透光面,只能使用鏡頭紙和綢布。

                    ③ 嚴禁加熱烘烤。急用干的杯子時(shí),可用酒精蕩洗后用冷風(fēng)吹干。決不可用超聲波清洗器清洗。

                    ④吸收池的校正:要固定參比杯和樣品杯,可在杯的毛玻璃面上寫(xiě)上記號。用盛有參比液的參比杯和樣品杯測定吸光度“A0”,樣品杯換上樣品液后測定的吸光度為“A1”,則校正后的實(shí)際吸光度A為:A= A1-A0高檔的分光光度計有自動(dòng)置零系統,可將二個(gè)杯子的偏差置零。 


                    其他重要附件:

                    高檔分光光度計的樣品室還可以更換各種重要附件,用于各種特殊量測。如換上“積分球”,可用來(lái)檢測微弱透光和不透光的樣品。換上“凝膠掃描裝置”,可用于電泳凝膠膠條上樣品帶的掃描測量。

                    ⑷ 檢測器:檢測器是一種光電轉換設備,即把光強度以電訊號顯示出來(lái),常用的檢測器有光電管,光電倍增管和光電二極管等三種。

                    ①光電管:光電管可檢測10微微安(10-11A)的光電流,管內抽真空充入惰性氣體,常用國產(chǎn)真空光電管有GD-5蘭敏光電管(適用波長(cháng)為210~625nm);GD-6紅敏光電管(適用波長(cháng)為625~1000nm)。751型分光光度計即使用這兩只光電管。

                    ②光電倍增管:它是檢測弱光的最靈敏最常用的光電元件,其靈敏度比光電管高200多倍,光電子由陰極到陽(yáng)極重復發(fā)射9次以上,每一個(gè)光電子最后可產(chǎn)生106~107個(gè)電子,因此總放大倍數可達106~107倍,光電倍增管的響應時(shí)間極短,能檢測10-8~10-9秒級的脈沖光。其靈敏度與光電管一樣受到暗電流的限制,暗電流主要來(lái)自陰極發(fā)射的熱電子和電極間的漏電。

                    ③光電二極管:其原理是這種硅二極管受紫外~近紅外輻射照射時(shí),其導電性增強的大小與光強或正比。近年來(lái)分光光度計使用光電二極管作檢測器在增加,雖然其靈敏度還趕不上光電倍增管,但它的穩定性更好,使用壽命更長(cháng),價(jià)格便宜,因而許多著(zhù)名品牌的高檔分光光度計都在使用它作檢測器。尤其值得注意的是由于計算機技術(shù)的飛速發(fā)展,使用光電二極管的二極管陣列分光光度計有了很大的發(fā)展,二極管數目已達1024個(gè),大大提高了分辨率。這種新型分光光度計的特點(diǎn)是“后分光”,即氘燈發(fā)射的光經(jīng)透鏡聚焦后穿過(guò)樣品吸收池,經(jīng)全息光柵色散后被二極管陣列的各個(gè)二極管接收,信號由計算機進(jìn)行處理和存儲,因而掃描速度極快,約10ms就可完成全波段掃描,繪出吸光度、波長(cháng)和時(shí)間的三維立體色譜圖,可以最方便快速地得到任一波長(cháng)的吸收數據,它最適宜用于動(dòng)力學(xué)測定,也是高效液相色譜儀最理想的檢測器。

                    ⑸ 顯示裝置:低檔分光光度計現在已都使用數字顯示,有的還連有打印機?,F代高性能分光光度計均可以連接微機,而且有的主機還使用帶液晶或CRT熒屏顯示的微處理機和打印繪圖機,有的還帶有標準軟驅?zhuān)嫒祿臃奖悖ɡ鏢PECORD200)。


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